植物過(guò)氧化物酶POD活性測(cè)定試劑盒（分光法）
Plant Peroxidase Activity Assay Kit（Spectrophotometer Method） Ver.751165-2.0
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貨號(hào)
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名稱
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規(guī)格
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PD1050F
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植物過(guò)氧化物酶POD活性測(cè)定試劑盒（分光法）
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100次
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● 產(chǎn)品組成：
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組分貨號(hào)
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名稱
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規(guī)格
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貯存
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PD1050F-01
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提取緩沖液
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100 ml
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4℃
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PD1050F-02
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試劑1-顯色劑
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25 ml
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4℃，避光
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PD1050F-03
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試劑2-分析緩沖液
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80 ml
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4℃
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PD1050F-04
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試劑3-酶底物
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6 ml
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4℃，避光
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● 產(chǎn)品簡(jiǎn)介：
過(guò)氧化物酶（Peroxidase，POD）是一種活性較高、廣泛存在于植物組織器官中的氧化還原酶，以鐵卟啉為輔基，能催化過(guò)氧化氫（H2O2）直接氧化酚類或胺類化合物，具有消除過(guò)氧化氫和酚類、胺類毒性的雙重作用，有效防止過(guò)氧化氫在體內(nèi)的積累，從而對(duì)植物體起到保護(hù)作用；同時(shí)，過(guò)氧化物酶能使植物組織中所含的某些碳水化合物轉(zhuǎn)化成木質(zhì)素,是細(xì)胞木質(zhì)素合成途徑中間的關(guān)鍵酶。所以，POD與植物體內(nèi)物質(zhì)代謝及抗逆性都有著密切關(guān)系。
測(cè)定原理：用愈創(chuàng)木酚（即鄰甲氧基酚，GA，Guaiacol）為過(guò)氧化物酶的底物，在過(guò)氧化物酶催化下，過(guò)氧化氫可將愈創(chuàng)木酚氧化成紅棕色的2-鄰甲氧基苯酚（2-GA），反應(yīng)方程式2H2O2 + 2GA→2-GA + 4H2O，2-GA在470 nm處有最大吸收，故可通過(guò)測(cè)470 nm下吸光值變化測(cè)定過(guò)氧化物酶活性。
該試劑盒使用分光光度計(jì)，用1 ml比色皿測(cè)定植物樣品中的POD活性，以每次提取使用1 ml提取液，1 ml反應(yīng)體系計(jì)算，該產(chǎn)品可以大約使用100次。
本試劑盒適用于檢測(cè)植物組織中的過(guò)氧化物酶(POD)活力，不推薦用于動(dòng)物組織、動(dòng)物細(xì)胞、細(xì)菌以及血清樣品中POD的檢測(cè)。
● 貯存、運(yùn)輸及效期：
4℃貯存；常溫運(yùn)輸；有效期一年。
● 自備材料：
植物材料；研缽；石英砂；聚乙烯聚吡咯烷酮（PVPP）；1 ml玻璃比色皿（光程1 cm）；分光光度計(jì)儀（檢測(cè)波長(zhǎng)470 nm）；低溫臺(tái)式離心機(jī)；可調(diào)式移液器；冰；蒸餾水。
● 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備：
1. 分光光度計(jì)預(yù)熱30 min，設(shè)定波長(zhǎng)到470 nm。
2. 測(cè)定前提前30 min取出試劑1、 試劑2和試劑3，平衡至常溫（25℃）。
3. 提前打開制冰機(jī)。
● 操作步驟：
建議正式實(shí)驗(yàn)前，選取2個(gè)樣本做預(yù)測(cè)定，了解實(shí)驗(yàn)樣品情況，熟悉流程，避免樣本和試劑浪費(fèi)。
一. 樣本POD提?。?/b>
1.1 取新鮮植物組織，按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積（ml）為~1：10的比例用研缽進(jìn)行冰浴研磨，制備成~10%植物勻漿液，如0.1 g 植物葉片，加入1 ml提取液，用研缽進(jìn)行冰浴研磨。
注：對(duì)于纖維含量多的植物如水稻葉片，可加入適量石英砂（試劑盒不提供，自備）輔助研磨，提高研磨效率；對(duì)于多糖多酚含量高的植物，可以在提取液中加入1% PVPP（試劑盒不提供，自備），能有效去除多糖多酚對(duì)活性測(cè)定的干擾。
1.2 12000 rpm，4℃離心10 min，取上清，即為含有POD的樣本，置冰上測(cè)定。
注：提取的樣本如需貯存，4℃貯存3天；建議按需分裝后-80℃貯存，兩周內(nèi)使用，盡量避免反復(fù)凍融；不建議-20℃貯存。
二. 樣本測(cè)定：
2.1 在1.5 ml離心管中依次加入：
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加入順序
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試劑名稱
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對(duì)照體系
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測(cè)定體系
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反應(yīng)總體積1 ml
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1
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樣本
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-
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x
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2
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試劑1-顯色劑
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200
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200
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3
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試劑2-分析緩沖液
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750
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750-x
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4
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試劑3-酶底物
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50
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50
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離心管中混勻后，用對(duì)照體系將儀器調(diào)零；隨后立即將反應(yīng)體系轉(zhuǎn)移到1 ml比色皿中，在 470 nm處讀取吸光值 A1以及反應(yīng)時(shí)間后的吸光值A2，△A=A2-A1，可以間隔1 min讀數(shù)，讀取5 min內(nèi)的數(shù)值。
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注1：10%植物勻漿液x經(jīng)驗(yàn)值一般為50-200
μl。
注2：若吸光值的上升趨勢(shì)不穩(wěn)定，可全部加完所有試劑后讀取5 min內(nèi)每間隔1 min的吸光值，根據(jù)時(shí)間對(duì)吸光值做線性回歸曲線，選取一段線性增長(zhǎng)范圍讀取△A值（參見實(shí)驗(yàn)示例）。
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2.2 由于植物樣本繁多，不同物種的POD活性差異很大，有的物種活性很高（反應(yīng)啟動(dòng)后混合液顏色很快由橘黃色變?yōu)榧t褐色）；有的物種活性很低（反應(yīng)啟動(dòng)后 5 分鐘內(nèi)混合液不變色，吸光值只有小數(shù)點(diǎn)后三位的變化）。強(qiáng)烈建議先取 2-3 個(gè)樣本做個(gè)預(yù)測(cè)定，如果反應(yīng)啟動(dòng)后混合液顏色很快由橘黃色變成紅褐色，A1值大于0.6
或 A2 值大于1.5 或ΔA大于1，說(shuō)明酶活性過(guò)高，可降低樣本量 x，也可將樣本用提取緩沖液稀釋后（稀釋倍數(shù)為D）重新檢測(cè)。如果 A1 值很?。ǎ?.02），且△A 很?。ǎ?.005，隨時(shí)間延長(zhǎng)A470幾乎不變化），且反應(yīng)啟動(dòng)后一段時(shí)間沒有顯色（一般5 min內(nèi)），說(shuō)明酶活性很低，可增加樣本量x。
三. 活性計(jì)算：
3.1 按樣本鮮重（FW）計(jì)算：
3.1.1 酶活定義：每克植物組織鮮重（FW）每分鐘在1 ml反應(yīng)體系中使470 nm 處吸光值增加1為一個(gè)酶活力單位U。
計(jì)算公式：POD活性（U/g FW）=
?AFW×1T×V總V樣×D
注解：
△A：在時(shí)間T內(nèi)A470的增加值
FW（g）：樣本提取中使用植物材料的鮮重克數(shù)
T（min）：讀取兩次A470的間隔反應(yīng)時(shí)間
V總（ml）：樣本提取中加入提取液的總體積
V樣（ml）：微孔板中加入的樣本體積x μl，轉(zhuǎn)換為ml數(shù)
D= 樣本稀釋倍數(shù)，未稀釋為1
3.1.2 計(jì)算示例：
取0.5 克綠蘿葉片（FW=0.5），加入5 ml提取液（V總=5）冰浴勻漿，制成10%勻漿液，12000 rpm 4℃離心10 min，取上清置于冰上，取50 μl樣本（V樣=0.05）按照測(cè)定步驟操作，使用1 ml石英比色皿（光徑1 cm），設(shè)定分光光度計(jì)檢測(cè)波長(zhǎng)470 nm，間隔1 min記錄數(shù)據(jù)，采集5次；時(shí)間對(duì)吸光值做線性回歸曲線，3-4 min線性較好，1 min內(nèi)△A=0.426-0. 3=0.126。計(jì)算POD（U/g FW）=0.126/0.5×1/1×5/0.05×1= 25.2 U/g FW
3.2 按樣本蛋白濃度計(jì)算：
3.2.1 注：此方法需要測(cè)定樣本的蛋白濃度，推薦使用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（貨號(hào):RTP7102）。
酶活定義：每毫克蛋白（mg prot）每分鐘在1 ml反應(yīng)體系中使 470 nm 處吸光值增加1為一個(gè)酶活力單位 U。
計(jì)算公式：POD活性（U/mg prot）=
?AV樣×Cpr×1T×D
注解：
△A：在時(shí)間T內(nèi)A470的增加值
V樣（ml）：酶促反應(yīng)中加入的樣本體積x μl，轉(zhuǎn)換為ml數(shù)
Cpr：樣本蛋白濃度（mg/ml）
T（min）：讀取兩次A470的間隔時(shí)間
D：樣本稀釋的倍數(shù)，未稀釋即為1
3.2.2計(jì)算示例：
綠蘿POD活性測(cè)定-按樣本蛋白濃度計(jì)算：取0.5 克綠蘿葉片，加入5 ml提取液冰浴勻漿，制成10%勻漿液，12000 rpm 4℃離心10 min，取上清置于冰上，BCA蛋白定量試劑盒（貨號(hào)：RTP7102）測(cè)定蛋白濃度為2 mg/ml（Cpr=2）；按照測(cè)定步驟操作，取50 μl樣本（V樣=0.05）測(cè)定，設(shè)定酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)470 nm，間隔1 min采集數(shù)據(jù)，采集5次；時(shí)間對(duì)吸光值做線性回歸曲線，1-6 min（T=5）線性較好，5 min內(nèi)△A=0.459-0.067=0.392。計(jì)算公式： POD（U/mg prot）=0.392/（0.05×2）×1/5×1=0.784 U/mg prot。
